Bộ xét nghiệm định lượng protein Coomassie (Bradford)

Hai trong số các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để định lượng nồng độ protein là phương pháp Bradford và phương pháp BCA. Nguyên lý của phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết nhanh chóng của G250 màu xanh rực rỡ Coomassie với protein. Độ hấp thụ tối đa của Coomassie Brilliant Blue G25{{10}} là 488 nm ở trạng thái tự do. Sau khi liên kết với protein, độ hấp thụ tối đa thay đổi thành 595 nm. và giá trị hấp thụ ánh sáng tỷ lệ thuận với hàm lượng protein, vì vậy nó có thể được sử dụng để phát hiện định lượng protein. Phương pháp này xác định nồng độ protein không phụ thuộc vào các hóa chất trong phần lớn các mẫu, có thể cao tới 1 mM đối với -mercaptoetanol và 5 mM đối với dithiothreitol; Tuy nhiên, bị ảnh hưởng bởi nồng độ chất tẩy cặn cao hơn một chút, cần đảm bảo rằng hàm lượng SDS nhỏ hơn 0,01%, hàm lượng Triton X-100 nhỏ hơn 0,05% và Tween-20, Nội dung Tween-60, Tween-80, v.v. nhỏ hơn 0,015%. Bộ phát hiện định lượng protein BCA (G2026) do công ty chúng tôi sản xuất được khuyên dùng cho các mẫu có chứa chất tẩy cặn.

Bộ này hoạt động dễ dàng và nhanh chóng, có độ nhạy cao và tốc độ phát hiện cực nhanh, đồng thời có thể phát hiện nồng độ protein dao động từ 25-1000 ug/mL.

Sản phẩm được vận chuyển ở nhiệt độ phòng. Bovine Serum Albumin (BSA) Standard Ampules được bảo quản ở nhiệt độ 4 độ, có giá trị trong 12 tháng. Dung dịch chuẩn protein, được chuẩn bị bằng BSA Standard Ampules và Standard Ampules Dilution, bảo quản ở nhiệt độ -20 và sử dụng trong vòng 6 tháng.

1. Chuẩn bị dung dịch gốc protein chuẩn:Pha loãng 25 mg ống tiêm chuẩn Albumin huyết thanh bò (BSA) thành 1 mL ống tiêm chuẩn; Nồng độ của dung dịch gốc chuẩn Protein là 25 mg/mL và cần được bảo quản ở nhiệt độ -20.

2. Chuẩn bị dung dịch làm việc chuẩn protein:Một lượng thích hợp 25 mg/mL Dung dịch chuẩn gốc protein được pha loãng 50 lần với PBS hoặc nước muối sinh lý thông thường để thu được Dung dịch làm việc tiêu chuẩn protein với nồng độ cuối cùng là 0,5 mg/mL. Cẩn thận pha loãng theo phương pháp 10-gradien gấp để đảm bảo độ pha loãng chính xác.

3. Xây dựng đường chuẩn (phương pháp đọc vi đĩa):Dung dịch làm việc chuẩn protein được thêm vào đĩa giếng {{0}}tại 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μL, sau đó là PBS hoặc nước muối thông thường lần lượt được thêm vào cùng một đĩa giếng 96-ở 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4, 0 μL để tạo thành gradient hoạt động ở trên dung dịch thành 20 µL. Nồng độ protein của đường cong gradient là 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 và 500 ug/mL.

4. Chuẩn bị mẫu:Pha loãng mẫu cần xét nghiệm một cách thích hợp (bằng cách phát hiện trước khi thí nghiệm, nồng độ protein của mẫu có thể nằm trong phạm vi của đường chuẩn để đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm). Thêm 20 μL mẫu vào đĩa giếng 96-. Mẫu cần kiểm tra và chất chuẩn protein được pha loãng với cùng một dung dịch.

5. Giao thức ống nghiệm:

a) Thêm 200 µL thuốc nhuộm Coomassie G{1}} vào mỗi ống và trộn đều (Đĩa giếng 96-có thể được lắc trên xoáy trong 30 giây).

b) Ủ mẫu trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng (RT).

c) Đường cong tiêu chuẩn số 0 được sử dụng làm tham chiếu và được đo màu ở bước sóng 595 nm và giá trị độ hấp thụ của từng giếng được ghi lại.

d) Tính toán: Lấy hàm lượng gradient protein (ug/mL) trên đường chuẩn làm tọa độ ngang và giá trị độ hấp thụ làm tọa độ dọc và vẽ đường chuẩn. Theo giá trị độ hấp thụ của mẫu đo được, nồng độ protein (ug/mL) của mẫu cần kiểm tra trong các giếng tương ứng có thể được tìm thấy trên đường cong chuẩn, sau đó nhân với độ pha loãng của mẫu là protein thực tế nồng độ của mẫu cần kiểm tra.

e) Ngoài ra: nếu đo bằng máy quang phổ, hãy thay đổi thể tích phản ứng chuẩn gradient thành 1 mL ở bước 3. Thêm 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL dung dịch làm việc tiêu chuẩn protein (nồng độ của 0,5 mg/mL) vào 7 ống nghiệm thủy tinh sạch hoặc ống đo màu, sau đó thêm 1.0, 0.95, 0.9, {{28 }}.8, {{30}}.6, 0.4, 0.2, 0 mL PBS hoặc nước muối vào từng ống theo thứ tự, sau đó nạp thêm độ dốc dung dịch làm việc thành 1 mL. Dung dịch làm việc của gradient được bổ sung thành 1 mL và mỗi ống được trộn kỹ để thu được đường cong gradient với nồng độ protein là 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/mL.

f) Mẫu protein cần thử được pha loãng thích hợp và cho vào ống nghiệm thủy tinh mới hoặc ống đo màu với thể tích mẫu là 1 mL.

g) Thêm 3 mL thuốc nhuộm Coomassie G-250 vào từng ống gradient đường cong tiêu chuẩn và ống mẫu ở trên, trộn kỹ và để yên trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng để phát hiện so màu bằng máy đo quang phổ.

h) Bước sóng của quang kế được đặt ở 595 nm trong quá trình phát hiện, và đường cong chuẩn và mẫu cần kiểm tra được phát hiện với ống đường cong tiêu chuẩn số 0 làm tham chiếu cho việc điều chỉnh điểm không. Vẽ đường chuẩn và tính nồng độ protein trong mẫu cần xét nghiệm theo phương pháp ở bước 6.

1. Thuốc nhuộm Coomassie G-250 phải được đưa về nhiệt độ phòng và trộn ngược trước khi sử dụng để tránh ảnh hưởng đến độ nhạy của xét nghiệm.

2. Khi chuẩn bị dung dịch gốc protein chuẩn, hãy đảm bảo rằng dung dịch này được hòa tan tốt. Nên pha loãng dung dịch làm việc tiêu chuẩn protein theo độ dốc 10-gấp, không pha loãng 50 lần một lần để tránh sai số lớn.

3. Vui lòng đeo kính an toàn, găng tay hoặc quần áo bảo hộ.

Chỉ dành cho mục đích nghiên cứu!

Chú phổ biến: bộ xét nghiệm định lượng protein coomassie (bradford), nhà sản xuất, nhà cung cấp, nhà máy sản xuất bộ xét nghiệm định lượng protein coomassie (bradford) Trung Quốc